Vilniaus universitetas

Proteomikos centras

Lietuvos biochemiku draugija


Orai Vilniuje

Ksenobiotikų biochemijos skyrius

tel.: 85 272 90 42
faks. 85 272 91 96

Veikla

Mokslinių tyrimų kryptis – ksenobiotikų oksidacinės-redukcinės reakcijos biologinėse sistemose.

1. Flavininių fermentų reakcijų su chinoniniais ir nitroaromatiniais ksenobiotikais tyrimai.
  Daugelis priešnavikinių, antiparazitinių, antimikrobinių preparatų savo sudėtyje turi chinonines arba nitroaromatines grupes. Be to, chinonai ir nitroaromatiniai junginiai yra kenksmingi aplinkos taršalai (pesticidai, automobilių išmetamųjų dujų komponentai, sprogmenų likučiai aplinkoje). Šių junginių terapinis arba toksiškas poveikis dažniausiai susietas su jų vien- arba dvielektronine redukcija organizme, kurią atlieka įvairūs flavininiai fermentai. Vienelektroninė redukcija, katalizuojama flavininių elektrontransferazių, inicijuoja laisvųjų radikalų ir aktyvuotųjų deguonies formų susidarymą bei “oksidacinį stresą”. Dvielektroninės redukcijos, kurią katalizuoja žinduolių DT-diaforazė ir bakterijų “deguoniui nejautrios” nitroreduktazės, poveikis yra keleriopas - ji sumažina daugelio chinonų toksiškumą, nes susidarę hidrochinonai gali lengviau pasišalinti iš organizmo, bet didina nitroaromatinių junginių toksiškumą, nes susidarę nitrozo junginiai ir hidroksilaminai modifikuoja DNR. Antra vertus, šios reakcijos yra svarbi nitroaromatinių aplinkos taršalų biodegradacijos pakopa.
 Bendradarbiaujant su Saragosos universitetu (Ispanija) (NATO finansuotas projektas LST.CLG. 97882), ištirtas chinonų ir nitroaromatinių junginių redukcijos mechanizmas ferredoksin: NADP+ reduktaze (vienelektroninė redukcija) ir jos Glu301Ala mutantu (mišri vien- ir dvielektroninė redukcija) (Anusevičius ir kt., 1997, 2005). Nustatyta, kad reakcijos greitis didėja, didėjant junginių vienelektroninės redukcijos potencialui (E17) (išorinės sferos elektrono pernešimo mechanizmas) arba neigiamėjant žemiausios vakantinės molekulinės orbitalės (LUMO) energijai. Redukcijos mechanizmo pokytis susietas su flavino radikalo destabilizacija mutante, o dvielektroninė redukcija yra daugiapakopė (e-,H+,e-). Šis mechanizmas galioja ir mišriai vien- ir dvielektroninei chinonų ir nitroaromatinių junginių redukcijai FAD/SS fermentu tioredoksinreduktaze iš Arabidopsis thaliana (Bironaitė ir kt., 1998; Miškinienė ir kt. 1998; Nivinskas, H. ir kt.,2001) (bendradarbiavujant su Nancy universitetu, NATO finansuotas projektas LG.972012). Nustatytas fermento redoks potencialas, parodyta, kad chinonus ir nitroaromatinius junginius redukuoja redukuotas FAD. Bendradarbiaujant su Karolio institutu (Stokholmas), vykdydant projektą „Chinonai ir aromatiniai nitrojunginiai, kaip rekombinantinės žinduolių tioredoksinreduktazės inhibitoriai ir subversyvūs substratai“ (projektą rėmė Švedijos Mokslų akademija) nustatyta, kad žinduolių FAD/SS/SeS fermento tioredoksinreduktazės –SeS- kofaktorius gali dalyvauti chinonų ir nitroaromatinių junginių redukcijoje kaip ir FAD (Čėnas ir kt., 2003,2004). Šie tyrimai atskleidė naują, iki šiol beveik nežinomą selenocisteininių kofaktorių katalizės aspektą. Identifikuota fermento redoks forma, dalyvaujanti šiose reakcijose, nustatytas jos redukcijos potencialas. Nustatyta, kad greitas šio fermento redukuoto –SeS- modifikavimas chinonais ir nitroaromatiniais junginiais gali būti svarbus jų toksiniame poveikyje.
 Tiriant dvielektroninę chinonų ir nitroaromatinių junginių redukciją, nustatyta, kad DT-diaforazės reakcingumas didėjant chinonų E17 ir mažėjant jų van der Vaalso tūriui (VdWvol) (Anusevičius ir kt., 2002a ir 2002b; Čėnas ir kt., 2004). Chinonai su VdWvol > 200 Å3 jungiasi kitame aktyvaus centro domene, nei mažesnio tūrio chinonai, dėl to susilpnėja jų elektroninė sąveika su FAD. Nitroaromatiniai junginiai yra labai neaktyvūs DT-diaforazės substratai dėl analogiškų priežasčių (Šarlauskas ir kt., 1997; Miškinienė ir kt., 1997). Nustatyta, kad skirtingai nuo hidroksilaminų susidarymo kitų nitroaromatinių junginių redukcijoje, DT-diaforazė atlieka vienelektroninį sprogmens tetrilo N-denitrinimą (Anusevičius ir kt., 1998). „Deguoniui nejautri“ nitroreduktazė iš Enterobacter cloacae redukuoja polinitroaromatinius junginius į mono-, o po to į dihidroksil-aminus, reakcijos greitis didėja didėjant junginių E17 arba neigiamėjant junginių vienelektroninės ar hidridinės redukcijos entalpijai, apskaičiuotai kvantomechaniniais metodais (Nivinskas, H. Ir kt., 2000, 2001; Šarlauskas ir kt., 2004). Šiuo atveju chinonų reaktingumas mažesnis nei panašaus redukcijos potencialo nitroaromatinių junginių (Nivinskas, H., 2002). Tai sąlygota jų rišimusi skirtinguose aktyviojo centro domenuose.
  Susintetinus eilę naujų nitroaromatinių junginių (priešnavikinių agentų analogų, sprogmenų, raketinio kuro komponentų), pagal vienelektroninės fermentinės redukcijos greičio konstantas nustatyti jų E17 (Šarlauskas ir kt., 2000, 2004, 2006). Šių junginių spektrinės savybės buvo tiriamos dalyvaujant LMSF finansuotame Aukštųjų technologijų plėtros programos projekte „Lazerinės ir infraraudonos spektrometrinės atmosferos taršalų nuotolinio aptikimo sistemos“ (LISATNAS, projekto koordinatorius – Fizikos institutas), kurio tikslas sukurti nuotolinius lazerinius aplinkos taršalų, tame tarpe ir nitroaromatinių sprogmenų, detekcijos prietaisus.

2. Chinoninių ir nitroaromatinių junginių citotoksiškumo mechanizmų tyrimai.
  Bendradarbiaujant su VU Imunologijos instituto mokslininkais, nustatyta, kad pagrindinis modelinių chinonų ir gamtinių antrachinoninių pigmentų citotoksiškumo mechanizmas FLK (galvijų leukemijos virusu transformuoti ėriuko fibroblastai) ir žmogaus leukeminėse HL-60 ląstelėse yra oksidacinis stresas (Dičkancaitė ir kt., 1997, 1998). Pademonstruotas ryšys tarp jų citotoksiškumo ir fermentinių oksidacinį stresą sukeliančių reakcijų greičio. Selektyvi priešnavikinio chinono daunorubicino akumuliacija ląstelėse (100-1000 kartų) gali būti atsakinga už jo daug didesnį toksiškumą, nei galima tikėtis pagal jo E17, tačiau jo toksiškumas iš esmės yra prooksidacinis (Dičkancaitė ir kt., 1997; Nemeikaitė-Čėnienė ir kt., 2005d). Tiriant RH1, MeDZQ, AZQ, BZQ ir kitų priešnavikinių aziridinil-pavaduotų benzochinonų citotoksiškumą, pirmą kartą atskirai kiekybiškai įvertinti trys citotoksiškumo faktoriai – oksidacinis stresas, aktyvacija DT-diaforaze, ir tiesioginė DNR modifikacija (Nemeikaitė-Čėnienė ir kt., 2003). Pirmieji du faktoriai yra vienodai svarbūs ir minėtų junginių sukeltoje apoptozėje, kuri vyksta daug efektyviau nei veikiant aziridinil-nepavaduotiems chinonams (Nemeikaitė-Čėnienė ir kt., 2005a).
  Tiriant nitroaromatinių aukštos energijos ir modelinių junginių (nitrobenzenų, nitrofuranų, nitrobenzimidazolų, nitrobenzofuroksanų, nitrotriazolų) citotoksiškumą FLK ląstelėse ir pelės splenocituose, nustatyta, kad pagrindinis jo faktorius yra oksidacinis stresas, nors DT-diaforazės katalizuojamos reakcijos ir įtakojo citotoksiškumą (Šarlauskas ir kt., 1997, 2000, 2004; Nemeikaitė-Čėnienė ir kt., 2004, 2006; Misevičienė ir kt., 2006). Panašūs dėsningumai (efektyvumo didėjimas, didėjant E17) pastebėti ir nitroaromatinių junginių sukeltoje methemoglobinemijoje ir eritrocitų lizyje (Marozienė ir kt., 2001). Tiriant sprogmens 2,4,6-trinitrotolueno (TNT) amino- ir hidroksilamino- biodegradacijos produktus nustatyta, kad oksidacinis stresas yra pagrindinis jų citotoksiškumo faktorius, ir kad jie yra mažiau toksiški nei TNT (Šarlauskas ir kt, 2004, 2006a, 2006b). Tačiau –NH2 ir –NHOH grupės padidina šių junginių toksiškumą palyginus su šių grupių neturinčiais analogais. Tai rodo, kad šie biodegradacijos produktai išlieka pakankamai toksiški. Ištirta aziridino ir kitų alkilinančių grupių įtaka dinitrobenzamidų (CB-1954 ir jo analogai) ir nitrobenzimidazolų citotoksiškumui (Miškinienė ir kt., 1997, 1999; Šarlauskas ir kt., 1997, 2000). Nauji šios klasės sukurti junginiai buvo pakankamai aktyvūs Nacionalinio vėžio instituto (NCI, Bethesda, JAV) navikinių kultūrų rinkinyje (cL50 = 1-10 μM).
  Nustatyta, kad alkilinantiems chinonams ir nitroaromatiniams junginiams sukeliant ląstelės nekrozę ir apoptozę, vyksta tioredoksinreduktazės, bet ne gliutationreduktazės inaktyvacija (Čėnas ir kt., 2006). Ištirti ir aplinkos taršalo chromato fermentinės redukcijos ir citotoksiškumo mechanizmai (Nivinskas, H. ir kt, 2006).
  Bendradarbiaujant su Paryžiaus Nacionalinio gamtos istorijos muziejumi, nustatyta, kad gliutationreduktazės inhibicija nėra svarbi nulemiant nitroaromatinių junginių ir chinonų toksiškumą maliarijos parazitui Plasmodium falciparum (Grellier ir kt., 2001), o junginių poveikis didėja, didėjant jų E17 ir teigiamam elektrostatiniam krūviui (selektyvi akumuliacija). Šie rezultatai suformuoja naujas gaires antiplazmodinių ir kitų antiprotozoinių preparatų sintezėje. Bendradarbiaujant su COST B-22 veiklos (2005-2007 m.m.) partneriais, nustatyta, kad aziridinil-pavaduoti chinonai (RH1, MeDZQ ir kt.) pasižymi daug aukštesniu aktyvumu prieš P. falciparum, nei galima tikėtis iš jų E17 .

3. Prooksidantinio polifenolinių antioksidantų citotoksiškumo tyrimai.
  Gamtiniai ir sintetiniai polifenoliniai antioksidantai yra vertingi maisto komponentai bei pramoniniai maisto konservantai. Nuo 1990 m. vis intensyviau tyrinėjami šių junginių citoksiškumo/terapinio poveikio mechanizmai. Skyriaus mokslininkai vieni pirmųjų pasaulyje ištyrė ROS generaciją šiais junginiais (Dičkancaitė ir kt., 1998; Sergedienė ir kt., 1999; Metodiewa ir kt., 1999), bei nustatė labiausiai gamtoje paplitusio antioksidanto kvercetino oksiduotos formos ir pagrindinio ląstelių –SH antioksidanto gliutationo konjugacijos produktų struktūrą (Metodiewa ir kt., 1999; Boersma ir kt., 2000). Bendradarbiaujant su Wageningeno (Olandija), Uppsalos (Švedija) ir Poznanės (Lenkija) mokslininkais 1996-2001 m. vykdytas EK remiamas 4BP projektas “Redoks aktyvių maisto priedų toksinio poveikio pašalinimo antioksidaciniais maisto komponentais galimybių tyrimas”, (koordinatorius – Wageningeno universitetas). Bendradarbiaujant su VU Imunologijos instituto mokslininkais, pirmą kartą pasaulyje nustatyta, kad polifenolių ir flavonoidų citotoksiškumą nulemia jų vienelektroninės oksidacijos potencialas (E27) ir lipofiliškumas (log D), o citotoksiškumas yra sukeliamas šių junginių (auto)oksidacijos. Citotoksiškumą didina polifenolių hidroksilinimas arba oksidacinis demetilinimas citochromais P-450, o jį mažina metilinimas katechol-o-metiltransferaze (Nemeikaitė-Čėnienė ir kt., 2005b). Vykdant LVMSF projektą „Augalinės kilmės funkciniai ingredientai ir maisto priedai maisto saugai ir kokybei“ (koordinatorius - KTU), ištirtos naujo antioksidanto 5,8-dihidroksikumarino oksidacinės-redukcinės savybės ir citotoksiškumo mechanizmas (Nemeikaitė-Čėnienė ir kt., 2005c). Siekiant sukurti naujus antioksidacinius maisto priedus, buvo ištirtos keliolikos polifenolinių ekstraktų, išskirtų iš Lietuvoje augančių augalų, savybės. Nustatyta, kad oksidacijos produktai turi redoks aktyvius chinoninius fragmentus, kurių citotoksiškumas yra prooksidantinio pobūdžio. Bendradarbiaujant su Paryžiaus Nacionalinio gamtos mokslų istorijos muziejaus darbuotojais, buvo ištirtas polifenolių ir flavonoidų antimaliarinis poveikis in vitro.

4. Fotosensibilizacinių efektų moduliacija antioksidantais.
  1997-2005 m. dalyvaujant LVMSF programose “Lazerinė fotosensitizacija navikų terapijoje” ir “Šviesa biomedicinoje”
, ištirti struktūros-aktyvumo ryšiai polifenoliniams antioksidantams apsaugant eritrocitus nuo fotosensibilizuotos hemolizės (Kliukienė ir kt., 1997, Marozienė ir kt., 2000, Lukšienė ir kt., 2003). Nustatyta, kad pagrindiniai apsaugos efektyvumą nulemiantys faktoriai yra polifenolių lipofiliškumas ir oksidacijos potencialas. Atlikti ir analogiški polifenolinių augalų ekstraktų, tiolinių antioksidantų bei naujos klasės dihidropiridininių antioksidantų tyrimai (Kirvelienė ir kt., 2003). Parodyta, kad priešnavikiniai alkilinantys fenilalanino dariniai gali mažinti toksišką singletinio deguonies poveikį (Keršienė ir kt., 1998). Charakterizuoti žinduolių ląstelių antioksidacinių ir ksenobiotikus metabolizuojančių II-sios fazės fermentų aktyvumo pokyčiai fotodinaminės ir radioterapijos metu (Lukšienė ir kt., 2004).